Сравнительный анализ параметров гемостаза карликовых свиней и человека в процессе онтогенеза

Введение

Исследования системы гемостаза имеют значение не только при исследовании лекарственных средств, непосредственно влияющих на нее, но и в качестве одного из компонентов панели основных тестов для токсикологических исследований [1]. Карликовые свиньи являются подходящими моделями в доклинических исследованиях, направленных на изучение свойств антитромботических лекарственных препаратов, и в различных экспериментах, связанных с изучением системы гемостаза млекопитающих. Это обусловлено схожестью анатомии и физиологии карликовых свиней с организмом человека, возможностью формирования у них различных патологий, а также введения разнообразных форм лекарственных средств при использовании данной тест-системы [2, 3].

Для корректной оценки получаемых результатов в подобных исследованиях необходимо учитывать возможные колебания показателей гемостаза в связи с возрастом карликовых свиней, которые, как указано в литературе [4–6], могут наблюдаться. Кроме того, остается актуальным вопрос об экстраполяции получаемых данных о работе системы гемостаза свиней на человека [7].

Для исследования системы гемостаза человека и животных разработано большое количество тестов, наиболее часто определяют показатели активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и протромбинового времени (ПВ).

АЧТВ — наиболее чувствительный показатель, отражающий эффективность внутреннего пути свертывания и общего каскада свертывающей системы крови человека и животных. Длительность АЧТВ зависит от уровня высокомолекулярного кининогена, прекалликреина и факторов свертывания крови XII, XI, VIII и менее чувствительна при изменении уровня факторов X, V, протромбина и фибриногена. АЧТВ определяют по длительности образования кровяного сгустка после добавления в пробу крови кальция и парциального тромбопластина. Увеличение длительности АЧТВ связано с повышенным риском кровотечений, уменьшение — с тромбозом [8].

ПВ — время, характеризующее первую и вторую фазу плазменного гемостаза (протромбино- и тромбинообразование соответственно) и отражающее активность протромбинового комплекса (факторов свертывания VII, V, X и II) [9].

Также при оценке системы гемостаза представляет интерес активность плазминогена — параметра, устанавливающего способность плазминогена соединяться с ферментом стрептокиназой, образуя субстрат, необходимый для проведения дальнейшей ферментативной реакции. Плазминоген — белок плазмы крови, профермент, переходящий в определенных условиях в активную форму (плазмин), который является компонентом фибринолитической системы, необходимой для предотвращения чрезмерного образования кровяных сгустков (тромбов) в процессе свертывания крови [10].

Цель данного исследования — изучение основных параметров гемостаза и фибринолиза карликовых свиней в ходе их онтогенеза в сравнении с теми же параметрами у человека. Для выполнения поставленной цели необходимо выполнить следующие задачи: определить наличие и значимость различий между параметрами гемостаза для карликовых свиней разного возраста и пола, оценить влияние места забора пробы крови для анализа показателей гемостаза на получаемые результаты измерений, сравнить данные по основным показателям гемостаза, полученным в ходе эксперимента на свиньях, с таковыми у человека, указанными в различных источниках литературы.

Материал и методы

Для работы была использована кровь карликовых свиней породы Биштрассер Кнаус обоего пола различного возраста (от 2 мес до 6 лет), полученных в АО НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ». Кровь забирали в ходе лечебно-профилактических мероприятий, после чего карликовых свиней возвращали в стоковую популяцию, в связи с чем оценка со стороны биоэтической комиссии не проводилась. Карликовых свиней содержали в стандартных условиях в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях [11], в стандартных вольерах на подстиле («древесные пеллеты», производитель ООО Хоум Лаундж), площадь пола на одно животное составляла не менее 2 м². Кормление карликовых свиней проводили гранулированным, полнорационным кормом по утвержденному рациону, составленному на основании пищевых потребностей лабораторных животных, приготовленному по ГОСТу Р 52255–2004 «Национальный стандарт. Комбикорма для свиней. Номенклатура показателей». Кормление проводили 2 раза в сутки: с 8:00 до 9:30 и с 17:00 до 18:30. Животным давали воду, очищенную и нормированную по органолептическим свойствам, по показателям рН, сухого остатка, восстанавливающих веществ, диоксида углерода, нитратов и нитритов, аммиака, хлоридов, сульфатов, кальция и тяжелых металлов на основании СанПиН 2.13684–21 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». Воду при помощи кормушек-лотков давали ad libitum. Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды (18–27 °C и относительная влажность воздуха 30–70%), NH₃≤10 мг/м³, CO₂≤0,15 об.%. Световой режим составлял 12 ч света и 12 ч темноты. Для животных был установлен режим воздухообмена, обеспечивающий смену около 15 объемов помещения в час.

У основной массы карликовых свиней кровь отбирали из яремной вены натощак, после голодания в течение 8 ч, у свиней 3–6 лет дополнительно брали кровь также из ушной вены в пробирки с использованием в качестве антикоагулянта 3,8% цитрата натрия. Количество животных, у которых была отобрана кровь для определения показателей гемостаза, указано в табл. 1.

Кровь, отобранную в пробирки с использованием в качестве антикоагулянта 3,8% цитрата натрия, центрифугировали сразу после получения в течение 15 мин при 1480 g (3000 об/мин). Определение ПВ и АЧТВ в плазме крови свиней выполняли не позднее 1 ч после получения плазмы. Перед определением активности плазминогена плазму крови разбавляли в 3–5 раз водой очищенной.

Для оценки параметров гемостаза (ПВ и АЧТВ) использовали анализатор показателей гемостаза АПГ4-04‑П («ЭМКО», Россия), для определения АЧТВ — набор реагентов АПТВ-Эл-тест (№ 649 «Технология Стандарт», Россия), для определения ПВ — набор реагентов Техпластин-тест (№ 131, «Технология Стандарт», Россия), для исследования гемостаза — набор контрольных плазм (№ 717, «Технология Стандарт», Россия).

Для измерения активности плазминогена использовали набор Реахром-плазминоген (№ ФА-2, НПО «Ренам», Россия). Активность плазминогена определяли хромогенным оптическим методом. Метод определения активности плазминогена в образце плазмы основан на его способности образовывать комплекс со стрептокиназой, позволяющий гидролизовать пептидный хромогенный субстрат. Количество высвобождаемого при этом пара-нитроанилина (рNА) прямо пропорционально активности плазминогена в образце плазмы.

Оптическую плотность растворов при 405 нм по окончании реакции измеряли на микропланшетном анализаторе «CLARIOstar» (BMG Labtech, Германия).

Для расчета активности плазминогена анализируемых проб строили калибровочную зависимость изменения величины оптической плотности (по оси Y), полученной для каждого разведения плазмы-калибратора, от активности плазминогена в процентах (по оси Х) с помощью линейной аппроксимации: Y=aX+b. Коэффициент корреляции полученных линейных зависимостей составлял не менее 0,99. Активность плазминогена в плазме крови свиней рассчитывали с учетом коэффициента разведения образца.

Для всех показателей была применена описательная статистика: значения были проверены на соответствие закону нормального распределения. Проверку на соответствие закону нормального распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро–Уилка.

Полученные данные соответствовали закону нормального распределения, поэтому для их сравнения был использован t-критерий Стьюдента. Различия определяли при уровне значимости р<0,05.

Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism, Version 9.1.1.225 (Сан-Диего, США).

Результаты и обсуждение

В табл. 2–4 представлены результаты измерений ПВ, АЧТВ и активности плазминогена в пяти возрастных группах самцов и самок карликовых свиней. Данные, полученные из ушной и яремной вен для свиней в возрасте 3–6 лет, объединены.

Результаты измерений АЧТВ для самцов и самок всех возрастов соответствовали закону нормального распределения, оценка различий была выполнена с использованием t-критерия Стьюдента. Статистически значимых различий между значениями измерений АЧТВ самцов и самок всех возрастов не обнаружено.

Установлены статистически достоверные различия в измерениях ПВ и активности плазминогена у карликовых свиней разного возраста и пола, которые не являются клинически значимыми, так как в данном случае полученные p-значения не коррелируют с различиями в физиологическом состоянии животных и не будут оказывать влияние на принятие клинических или стратегических решений. Также для подтверждения обнаруженных в этом исследовании статистически значимых различий может потребоваться более крупное исследование с бóльшим количеством животных.

В соответствии с целями настоящего исследования сравнили результаты измерений АЧТВ, ПВ и активности плазминогена в плазме карликовых свиней, взятой из яремной и ушных вен карликовых свиней в возрасте 3–6 лет. Данные от самцов и самок объединены, поскольку различия между ними не наблюдалось. Статистической разницы между этими двумя способами забора образцов не обнаружено (табл. 5).

В литературе сведения о параметрах гемостаза для карликовых свиней немногочисленны, фрагментарны и достаточно противоречивы (табл. 6).

Расхождения в имеющихся результатах, вероятно, объясняются различными источниками получения массивов первичных данных параметров гемостаза, так как животные поступают из разных питомников, выращиваются в неодинаковых условиях, не говоря уже о различии используемых приборов и реагентов для измерения параметров гемостаза. Поэтому, вероятно, каждому исследовательскому учреждению, работающему с системой гемостаза карликовых свиней, следует выводить свои референсные интервалы и нормы.

Также в литературе встречается информация об изменениях показателей гемостаза в процессе онтогенеза — результаты этих измерений у более молодых животных отличаются от показателей взрослых свиней (см. табл. 6). Учитывая потенциальную востребованность свиней разного возраста в доклинических исследованиях, возможные возрастные изменения параметров гемостаза следует принимать во внимание при работе с карликовыми свиньями, так как показатели гемостаза, ошибочно интерпретированные как патологические, несмотря на то, что фактически это будет являться нормой, соответствующей определенному возрасту этих животных, могут повлиять на ход всего исследования и его результаты.

Помимо сравнения полученных значений АЧТВ и ПВ с данными литературы [12], также представляет интерес сравнение этих показателей гемостаза для карликовых свиней различного возраста с таковыми для людей разных возрастных групп, которые были установлены в нашем исследовании (табл. 7).

И у людей, и у карликовых свиней, согласно представленным [12] и полученным данным в настоящем исследовании, не наблюдается значительных изменений в продолжительности ПВ и АЧТВ с увеличением возраста. В других источниках литературы [13, 14] можно обнаружить отличающиеся результаты АЧТВ, однако тенденция к значительному увеличению или снижению в зависимости от возраста показателей ПВ и АЧТВ у людей отсутствует (табл. 8).

В исследовании были проанализированы основные параметры системы гемостаза (АЧТВ, ПВ и активность плазминогена) карликовых свиней разных возрастных групп, поскольку важно контролировать не только показатели, отражающие эффективность работы гемостаза, но необходимо еще и следить за эффективностью обратного процесса — тромболизиса.

В результате проведенного исследования установлены средние значения АЧТВ, ПВ и активности плазминогена для свиней пяти возрастных групп, самцов и самок, полученные из плазмы крови, взятой из яремных вен и вен ушей.

Достоверных различий между результатами измерений параметров гемостаза животных обоих полов в пяти возрастных группах в большинстве случаев не обнаружено, а единичная достоверная разница не имеет клинического значения. Таким образом, выводы о различиях в значении параметров гемостаза у животных разного возраста, встречающиеся в некоторых статьях, например, в работе [6], не подтвердились в условиях нашего исследовательского учреждения. В работе [15] возрастных отличий по изучаемым параметрам гемостаза также не найдено.

По результатам проведенного исследования не обнаружено достоверных различий между результатами измерений всех трех параметров гемостаза в плазме крови, полученной из яремной и ушной вен карликовых свиней.

Установленные результаты измерений параметров гемостаза карликовых свиней были использованы для расчета референсных интервалов значений АЧТВ, ПВ и активности плазминогена. Использовали объединенный массив данных по пяти исследованным возрастным группам. Для устранения влияния аномальных значений из массива данных были исключены статистические выбросы, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки [16]. Из дальнейшей работы были исключены как «extremes», или жесткие выбросы, так и «outliers», или мягкие выбросы.

Объединенные данные по всем возрастным группам обоего пола карликовых свиней о доле статистических выбросов по каждому показателю представлены в табл. 9.

Референсные интервалы для полученных результатов в зависимости от вида их распределения рассчитывали, как среднее ±1,96 × стандартное отклонение (Х_ср±1,96SD) для нормального распределения и как промежуток 2,5–97,5‰ для ненормального распределения. Вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка. Дополнительно проводили сравнение между животными разного пола с помощью U-критерия Манна–Уитни и t-критерия Стьюдента.

Полученные референсные интервалы значений АЧТВ, ПВ и активности плазминогена для карликовых свиней отражены в табл. 10.

Таким образом, установлено отсутствие достоверных клинически значимых различий между результатами измерений показателей АЧТВ, ПВ и активности плазминогена, полученных из плазмы крови, взятой из яремных и ушных вен карликовых свиней в возрасте 3–6 лет. Для установления наличия или отсутствия влияния места забора крови на результаты измерений показателей АЧТВ, ПВ и активности плазминогена для карликовых свиней других возрастов требуется провести дополнительные исследования. Также не обнаружено достоверных клинически значимых различий между результатами измерений показателей АЧТВ, ПВ и активности плазминогена, полученных из плазмы крови животных разного возраста и пола. Установленные значения были использованы для формирования референсных интервалов показателей АЧТВ, ПВ и активности плазминогена для карликовых свиней всех возрастов, которые могут быть использованы как универсальные для карликовых свиней различного возраста и для различных способов забора крови.

Результаты настоящего исследования об активности плазминогена у карликовых свиней аналогичны сведениям, приведенным в работах [17, 18]. Низкая активность плазминогена обнаруживалась и у других млекопитающих, например, у кроликов [19]. В целом значения активности плазминогена широко (в 10 раз и более) варьируют от таковых у грызунов и человека [19]. У людей активность плазминогена составляет в среднем 80–130% [10, 20], снижаясь до 60% от нормы (у детей до 6 мес) и увеличиваясь до 65% от нормы (у беременных в III триместре) [20], что превышает значения активности плазминогена у карликовых свиней. Причинами низкой активности плазминогена могут быть несколько факторов. Во-первых, использование неспецифичной тест-системы, содержащей в качестве калибратора плазму человека. Этот вариант объяснения также подтверждается межвидовыми различиями в аминокислотной последовательности плазминогена у свиней и человека [21]. Во-вторых, у карликовых свиней наблюдается высокая активность ингибитора плазмина α₂‑антиплазмина, что ведет к снижению активности плазминогена [18, 22]. Вероятно, какой‑либо из перечисленных факторов или их комбинация приводят в конечном итоге к низким значениям активности плазминогена. У тромболитической системы свиней есть и другие особенности, например, обнаружено, что тромбы у свиней имеют более высокую плотность сети фибрина, чем у человека, и хуже поддаются тромболизису [21, 23, 24]. Также есть сведения о различиях в результатах гистологических исследований между индуцированными тромбином тромбами у свиней in vitro и in vivo, что может поставить под сомнение результаты исследований тромболитической активности различных лекарственных веществ в моделях тромбов у свиней in vitro и in vivo [25]. Таким образом, карликовые свиньи являются неудачной моделью для изучения препаратов-тромболитиков.

Выводы

В представленной работе изучены основные параметры гемостаза и фибринолиза карликовых свиней в ходе их онтогенеза в сравнении с теми же параметрами для человека. По результатам проведенного исследования были сформированы следующие выводы об особенностях системы гемостаза и фибринолиза карликовых свиней.

1. Место забора крови (яремная вена или ушная вена) не влияет на параметры гемостаза у карликовых свиней в возрасте 3–6 лет разного пола.
2. Показатели ПВ и АЧТВ не зависят от возраста и пола карликовых свиней, референсные интервалы для данных показателей составляют 10,8–22,9 с для АЧТВ, 11,4–17,2 с для ПВ, в целом референсные параметры ПВ близки к таковым у человека. Референсные значения АЧТВ для свиней оказались ниже, чем средние показатели АЧТВ для людей. Также выявлено, что средние значения АЧТВ у свиней не изменялись с увеличением возраста, тогда как у людей этот показатель укорачивался с возрастом.
3. Активность плазминогена у карликовых свиней значительно ниже, чем у человека (80–140%), не зависит от возраста и пола, референсный интервал составляет 1,94–7,66%. Поэтому в связи с особенностью тромболитической системы карликовые свиньи не могут быть подходящей моделью для исследования веществ-тромболитиков.