Обоснование и разработка методики оценки долговременной и кратковременной памяти свиней на основе условного рефлекса добывания пищи в лабиринте

Введение

Когнитивные расстройства, возникающие вследствие токсических воздействий, нейродегенеративных и сосудистых заболеваний головного мозга, травм и других патологических процессов с вовлечением ЦНС, распространены среди современного населения и требуют разработки препаратов, препятствующих когнитивному снижению [1]. Кроме того, многие лекарственные препараты могут вызывать негативные побочные эффекты в виде ухудшения памяти, замедления мышления, дефицита внимания, отсутствие или наличие которых необходимо установить в рамках доклинических исследований безопасности и эффективности.

При проведении доклинических исследований новых лекарственных препаратов, способных влиять на когнитивные способности, актуален вопрос подбора релевантных методик оценки психических процессов и выбора биообъекта для определения не только простых поведенческих реакций, но и процессов функционирования нервной системы.

Обучение и память — сложные психические процессы, требующие участия высших функций мозга, а не просто получения серии вызванных ответов или соответствующего рефлекторного поведения [2]. При выборе моделей для исследования когнитивных функций при разработке и доклинической оценке новых лекарственных препаратов следует отдавать предпочтение наиболее подходящим методикам и тщательному выбору биообъекта, позволяющим получить достоверные, статистически значимые результаты, допускающие возможность адекватного переноса полученных экспериментальных данных на людей (трансляционные исследования) [3].

В настоящее время в практике доклинических исследований существует большое количество методических подходов по оценке таких сложных психических процессов, как внимание, память, обучение, тревожность, агрессия, однако они в первую очередь ориентированы на использование грызунов и в меньшей степени приматов, видов, которые традиционно считаются наиболее приемлемыми для переноса полученных данных для исследования на людях [4].

Цель исследования — обоснование возможности использования свиней в качестве модельного объекта с высокой трансляционностью с целью расширения спектра доступных методик для когнитивных и поведенческих исследований.

Задачи исследования.

1. Экспериментальная оценка возможности использования свиней мясных пород в когнитивных и поведенческих исследованиях.
2. Разработка на основе ближайших аналогов методики для оценки долговременной и кратковременной памяти свиней и ее апробация.

Состояние проблемы. Традиционно в поведенческих исследованиях принято использовать грызунов в основном благодаря наличию множества проверенных тестов и моделей [5, 6], а также легкости и дешевизне затрат, связанных с содержанием, по сравнению с более крупными животными. Однако на основе экспериментов по обучению крыс в разных типах лабиринтов основоположник когнитивного подхода к изучению поведения животных Э. Толмен пришел к выводу, что схема стимул—реакция недостаточна для описания сложного поведения, поскольку отвечает на вопрос, касающийся только совокупности элементарных откликов на стимулы. С точки зрения Э. Толмена, в процессе обучения животное приобретает знания обо всех деталях ситуации, сохраняет их в форме внутренних представлений и может использовать. В процессе обучения у животных формируется так называемая когнитивная карта или мысленный план всех характеристик лабиринта, а затем по нему они строят свое поведение. Мысленный план может воспроизводиться еще какое‑то время даже при отсутствии подкрепления. Аналогичной точки зрения придерживался и И.С. Бериташвили, основатель российской нейрофизиологической школы, который показал, что поведение собак, поставленных в ситуацию решения задачи, определяется не действующими в данный момент времени стимулами, а мысленными представлениями о них.

Преимущества использования свиней, в том числе мини-пигов, как модели в биомедицинских исследованиях, признаны еще в 70‑х годах прошлого века на основании того факта, что они способны быстро усваивать классические обусловленные задачи по методикам Б.Ф. Скиннера. В последнее 10‑летие наблюдается возрождение интереса к свинье как модели для изучения сложных психических процессов. Однако, несмотря на увеличение количества публикаций о когнитивных способностях свиней [7], опыт и знания относительно этого вида в качестве модельного биообъекта все еще ограничены. Использование свиней в научных целях составляет примерно 1% от общего числа животных различных видов [8]. Свиньи и мини-пиги имеют ряд преимуществ, которые делают их привлекательными для использования в исследованиях, в том числе вместе с другими видами лабораторных животных, особенно если конечная цель исследования включает экстраполяцию экспериментальных результатов на человека. По размерам органов, их массе и физиологии свиньи ближе к человеку, чем грызуны [8–10]. Относительно большой мозг свиней делает его пригодным для визуализации при инструментальных исследованиях, использовании МРТ и составлении функционально-когнитивной карты мозга [11, 12]. По данным зоологов и психофизиологов, свиньи способны различать несколько разнонаправленных стимулов при одновременном предъявлении в рамках одной задачи (запах, цвет, звук, вкус, форма) и выбирать правильный раздражитель для получения вознаграждения. По современным представлениям, использование свиньи как модели может заполнить пробел между доклиническими исследованиями на грызунах и клиническими испытаниями на людях [13–15], так как этот вид находится в промежуточном положении между приматами (трансляционность 63–71%) и грызунами (трансляционность 43%) [8, 16]. Они подходят для широкого спектра биомедицинских исследований, изучения эффектов психотропных препаратов, скрининга рецепторных профилей лекарств in vivo, а также для моделирования различных неврологических синдромов, например, паркинсонизма, вызванного черепно-мозговой травмой [17, 18].

Экспериментальные модели, разработанные для свиней, можно использовать для оценки влияния факторов образа жизни (стресса, злоупотребления алкоголем и наркотическими средствами, диабета, заболеваний головного мозга человека и др.) [10, 19, 20]. Еще одно важное преимущество заключается в том, что свиньи требуют меньших финансовых затрат на их приобретение и содержание по сравнению с приматами.

Проблема недостаточно широкого использования свиней в биомедицинских исследованиях поведения заключается на сегодняшний день в отсутствии хорошо стандартизированных и проверенных методик, чувствительных к изучаемым параметрам, в том числе тестов на обучение и память [4].

В зарубежной литературе встречается описание различных методик по пространственному обучению и оценке памяти животных с использованием различных типов лабиринтов, так называемые лабиринты последовательного выбора или свободного выбора. Лабиринты последовательного выбора, как правило, состоят из фиксированной стартовой позиции и фиксированной цели (кормушка с пищевым подкреплением, «награда»), при этом животное должно выучить один правильный маршрут к цели, избегая неверных альтернатив, таких как заход в тупики или повторное посещение уже проверенных отсеков или рукавов. В отличие от лабиринтов последовательного выбора задача свободного выбора [21, 22] совсем иная — «награды» можно найти в разных местах, а животное может свободно посещать все рукава или отсеки в любом порядке. Наиболее эффективным поведением считается однократное посещение только места с «наградой». В лабиринтах свободного выбора животные должны запомнить список мест, которые уже посещали, чтобы избежать повторного просмотра. Этот список посещений хранится в рабочей (оперативной, кратковременной) памяти и является актуальным только в рамках конкретного исследования. Информация о расположении фиксированного места, где можно найти «награду», и кратчайший путь к нему содержится в долговременной памяти и не зависит от конкретного испытания [23]. В лабиринтах свободного выбора можно одновременно оценивать рабочую и долговременную память. Как и большинство вариантов T- и Y-лабиринтов, применяемых в исследованиях на других видах животных, лабиринты для свиней не основаны на ориентации в пространстве, в котором они находятся, их следует рассматривать не как вариант пространственных, а как оперантные (или в некоторых случаях социальные) задачи.

В литературе [24] встречается описание экспериментальных исследований памяти свиней с применением различных конфигураций лабиринтов при использовании инструментального обучения или оперантного обусловливания по Скиннеру с положительным и/или отрицательным пищевым подкреплением. Описанные методики позволяют изучать различные аспекты памяти, ее восприимчивость к нарушению под воздействием различных факторов (влияние изменений среды содержания, стресс, боль, переключение внимания на другие стимулы). Ведется разработка методик исследования обучения и памяти для свиней, в которых можно контролировать и измерять несколько факторов, что в настоящее время является стандартной практикой для других видов животных. К таким методикам можно отнести многокомнатный лабиринт, который позволяет изучить тонкие нарушения обучения и памяти, либо сложный Т-образный лабиринт, где нужно найти «награду» в одном отсеке при первой попытке и в противоположном отсеке при второй попытке, в этом случае количество правильных выборов в течение нескольких тестирований будет характеризовать кратковременную память [20]. При этом внутримышечное введение холинолитика скополамина в дозе 0,4 мг/кг животным, которые до введения успешно выполняли задачу, приводит к увеличению количества ошибок при выполнении тестовой задачи и снижению скорости ее выполнения, что наглядно показывает, как тестирование в лабиринте позволяет оценить показатели памяти [21].

При разработке поведенческих методик для свиней необходимо учитывать, что они должны соответствовать определенным критериям:
1) здоровые животные должны иметь возможность освоить и выполнить задачу;
2) выполняемая задача должна позволять провести детальный анализ поведения свиней в различных поведенческих аспектах (когнитивных, сенсорных, двигательных или мотивационных) [25];
3) задача должна быть максимально свободной от стресса (как для экспериментального животного, так и для экспериментатора), кроме случаев, когда измерение воздействия стресса является целью исследования;
4) задача должна соответствовать экологически естественному для данного вида поведению с целью предотвратить сложности из‑за несоответствия задачи, выполняемой в эксперименте, поведенческим особенностям вида [26];
5) задача должна быть стандартизирована для внутрилабораторной и межлабораторной воспроизводимости [27];
6) задача должна быть по возможности автоматизирована, чтобы устранить зависимость от наблюдателя и позволять проводить точный анализ изучаемого показателя;
7) задания должны позволять исследовать развитие изучаемого эффекта во времени и предпочтительно подходить для повторных испытаний [28];
8) задача должна быть сложной и достаточно чувствительной, чтобы фиксировать тонкие различия в когнитивных способностях [29].

Для повышения мотивации животных к выполнению задачи и повышению ценности пищевой награды при выполнении тестирования часто применяют пищевую депривацию в виде уменьшения количества ежедневного рациона, хотя это не всегда необходимо [20, 30–32].

Материал и методы

Методика, разработанная на основе разновидностей Т-образного лабиринта для крыс и собак, предназначена для исследования влияния лекарственных препаратов и фармакологически активных веществ на долговременную и кратковременную память свиней, а также на их способность усваивать и выполнять программу.

В основе методики лежит формирование у свиней мысленного представления о пространственной структуре лабиринта, в который помещают животное, и о расположении в нем кормушки с подкреплением. Во время обучения у животных вырабатывали условный пищевой навык — свинья учится безошибочно заходить в отсек, где есть пищевая награда, воздерживаясь от посещения других отсеков. Критерием закрепления условного рефлекса в долговременной памяти считали безошибочное достижение свиньей пищевой приманки по кратчайшему пути.

В основе оценки влияния исследуемых препаратов на кратковременную память лежат механизм срыва закрепленного рефлекса и формирование нового опыта при негативном болевом подкреплении в зоне расположения привычной кормушки. Критерием формирования нового навыка считали выбор новой кормушки при игнорировании старой.

Апробирование методики проводили на свиньях-самцах породы Ландрас, полученных из племзавода ООО «Пламя» (г. Гатчина), в возрасте 3,4–4 мес, массой 35–45 кг. Животных содержали в помещении вивария в индивидуальных боксах размером 2,0×1,5 м с мелко решетчатым полом при 8‑часовом режиме освещения и температуре 18–22 °С, поддержании влажности не более 75% и соответствующей кратности воздухообмена. Дверь бокса представляла собой решетку с встроенной кормушкой, что позволяло сохранять животным визуальный и вокализационный контакт с соседями. Кормление животных проводили 2 раза в сутки комбикормом маркировки СК-5 (Тосненский комбикормовый завод) в соответствии с нормами кормления, предварительно замоченным в воде в соотношении 1 : 3. Доступ к воде ad-libitum осуществляли с помощью сосковых автоматических поилок. Дополнительный подстил и обогащение среды не использовали. Уборку боксов проводили ежедневно. Для привыкания животных к экспериментаторам ежедневно осуществляли хендлинг, который включал тактильный контакт в виде почесывания и поглаживания, вознаграждение (кусочки яблок, мармелад).

Дизайн исследования одобрен комитетом по этике биомедицинских исследований ГНИИИ ВМ МО РФ (протокол № 15 заседания комитета по этике ГНИИИ ВМ МО РФ от 17.07.20).

Тестирование проводили в лабораторных условиях при температуре 18–24 °С, относительной влажности 40–80% и постоянном освещении. Посторонний шум и воздействие прочих раздражителей сводили к минимуму, не допускали присутствия посторонних, не занятых в эксперименте сотрудников. За несколько дней до начала эксперимента животных подвергали режиму пищевой депривации, при котором ежедневный объем корма был сокращен на 20%, при этом вода находилась в свободном доступе.

Для апробации и оценки работоспособности методики использовали внутривенное введение в краевую ушную вену скополамина в дозе 0,28 мг/кг, полученной в результате аллометрического переноса максимальной эффективной дозы по нарушению памяти, установленной в предварительных экспериментах на крысах. Сравнение показателей контрольной (n=8) и экспериментальной групп (n=16) проводили с использованием непараметрического критерия Краскела–Уоллиса. Дескриптивные показатели статистики представлены как среднее и стандартное отклонение (M±SD)

Помещение лабиринта представляет собой комнату размером 7×7 м с четырьмя одинаковыми отсеками размером 3×3 м, содержащими Т-образную ширму, за которой спрятана пищевая награда (8 вариантов размещения, для каждой свиньи индивидуальное). Из клеток постоянного содержания свиней до комнаты с отсеками и кормушками ведет коридор длинной 25 м с двумя поворотами, время пробежки по которому учитывается при выполнении тестирования. Схема лабиринта представлена на рис. 1.

В качестве приманки с целью формирования навыка использовали небольшое количество (примерно 300 г) размоченного комбикорма для ежедневного кормления, для формирования нового навыка после срыва — 1 пакетик (85 г) влажного кошачьего корма «Sensory Smell» (Royal Canin, Франция). Перемещение из боксов содержания до лабиринта свиньи осуществляли самостоятельно, возвращение из лабиринта в бокс поощрялось кусочком яблока.

Методика оценки когнитивных способностей включает 4 этапа, на каждом из которых можно получить ценную информацию о действии исследуемого препарата (по приведенным критериям) на отдельные аспекты процесса запоминания и воспроизведения в зависимости от задачи исследования.

I этап — 1–10‑е сутки. Выработка пищедобывательного навыка. Этап основан на обучении свиней доходить кратчайшим путем от бокса постоянного содержания по коридору до комнаты с отсеками и ширмами к месту с пищевой наградой. Исследуемый показатель — скорость формирования навыка, то есть количество повторов (дней обучения) до устойчивого воспроизведения пищедобывательного навыка в заданных условиях.

Предварительно животных несколько дней обучали выходить из бокса и взаимодействовать с экспериментатором. Для формирования навыка животное заманивали (включая прохождение по коридору) в помещение лабиринта, предоставляя свободу перемещения по отсекам лабиринта в поисках пищи. После съедания приманки животных возвращали в место постоянного содержания. Выработку пищедобывательного навыка у свиней проводили в течение 5–10 дней до безошибочной пробежки до места расположения кормушки за минимальное время. Свиней, не желающих выходить из клеток, взаимодействовать с экспериментатором или заходить в комнату с лабиринтом, исключали из дальнейшего обучения и участия в эксперименте. После окончания сеанса тестирования с одним животным помещение лабиринта тщательно мыли, чтобы исключить следы его пребывания, которые могли повлиять на поведение следующего животного [влажная обработка пола разбавленным раствором тетрамина (ЗАО «Петроспирт», Россия)].

II этап — 11‑е сутки. Оценка исходного уровня условно-рефлекторной деятельности. Выполнение фонового тестирования.

III этап — 11–15‑е сутки. Оценка влияния исследуемого препарата на условно-рефлекторную деятельность свиней по добыванию пищи в лабиринте в различные временные промежутки после его введения. Животных выпускали из боксов и оценивали суммарное время пробежки до комнаты с лабиринтом и время прохода по лабиринту до кормушки, а также количество ошибок (за ошибку считали заход в отсек, где нет подкрепления). Оцениваемые показатели этапа: выполнение задания или отказ, скорость выполнения задания, количество ошибок при выполнении задания.

Полученные результаты сравнивали с аналогичным показателем при фоновом тестировании для каждого экспериментального животного и с показателями контрольной группой.

IV этап — 15–20‑е сутки. Оценка влияния исследуемых препаратов на оперативную (кратковременную) память свиней после их введения. Тестирование проводили на животных со сформированным навыком добывания еды в лабиринте. Для оценки влияния исследуемых препаратов на кратковременную память в день тестирования животных лишают закрепившегося навыка путем негативного болевого воздействия в привычной кормушке (несколько игл от инсулинового шприца, закрепленных на дне пустой привычной кормушки), одновременно обучают тому, что пищевое подкрепление расположено в другой кормушке на расстоянии 1,5 м от привычной. Подобное болевое воздействие не приводит к травмированию, однако является более значимым, чем ограничение доступа к привычной кормушке либо изменение вкуса приманки, что позволяет за короткий промежуток времени переориентировать животное на новое место расположения приманки, более привлекательной по вкусу. Новый навык формировали за 4 подхода с перерывом в 10 мин. Критерием выполнения теста после введения исследуемых препаратов считали безошибочный выбор новой кормушки с пищевым подкреплением. За ошибку считали выбор старого места пищевого подкрепления. Для оценки длительности нарушения памяти, вызванной исследуемыми препаратами, тестирование можно проводить в разные временные промежутки с контрольным испытанием через сутки. Полученные результаты сравнивают с аналогичными результатами контрольной группы.

Результаты исследования

Апробацию работоспособности методики и оценку ее валидности проводили при внутривенном введении скополамина (Scopolamine hydrochloride, Sigma-Aldrich) в дозе 0,28 мг/кг. Оценивали его влияние на долговременную и оперативную память. Контрольной группе вводили физиологический раствор (натрия хлорид 0,9%, ООО «Мосфарм», Россия) в аналогичном объеме. Результаты представлены в табл. 1.

К оцениваемым критериям разработанной методики можно отнести следующие, указанные ниже.

Во-первых, скорость формирования навыка по поиску пищевого подкрепления в определенном месте (количество тренировочных дней до безошибочного выполнения задачи за кратчайшее время) позволяет оценить ноотропное действие лекарственных средств либо выявить их негативное (побочное, нежелательное) влияние, например, при курсовом применении.

Во-вторых, скорость выполнения задачи при сформированном навыке на фоне введения исследуемого лекарственного препарата (субстанции) помогает выявить возможное влияние исследуемых препаратов на двигательный и мотивационный компонент поведенческого акта (если данные факты не были выявлены ранее на других видах животных либо при исследовании препаратов в других дозах).

В-третьих, факт выполнения задачи при сформированном навыке либо при получении новой информации о пищевом подкреплении в альтернативном месте на фоне введения исследуемого лекарственного препарата (субстанции) позволяет оценить действие исследуемого препарата на воспроизведение информации из долговременной или кратковременной памяти. При отсроченном тестировании через сутки можно оценить восстановление доступа к информации в долговременной памяти и влияние препарата на консолидацию памятного следа о новых условиях.

В-четвертых, количество ошибок при выполнении тестирования в обоих вариантах — дополнительный критерий, позволяющий подтвердить (заподозрить) негативное влияние исследуемых препаратов на когнитивные процессы.

Тестирование проводили через 5, 60 мин и 1 сут после введения скополамина.

Животные, получавшие внутривенно скополамин в дозе 0,28 мг/кг, в первые сутки наблюдения не смогли выполнить тест ни по поиску привычной кормушки, ни альтернативной, так как не вспомнили дорогу до комнаты с лабиринтом. При тестировании спустя сутки животные экспериментальных групп безошибочно находили кормушку в привычном им месте, что оценивали как выполнение теста при оценке долговременной памяти, однако информация о болевом подкреплении в ней в долговременной памяти не закрепилась, что считали ошибочным выполнением теста группой, где оценивалась кратковременная память. Контрольные животные безошибочно выбирали новое место в течение исследования и через 24 ч.

Заключение

Как показывает анализ источников литературы и настоящее исследование, свиньи представляются подходящим биообъектом для оценки когнитивных нарушений, в том числе под воздействием лекарственных препаратов. По затратам на приобретение и содержание свиньи значительно дешевле приматов, по размерам органов, их массе и физиологии свиньи достаточно близки к человеку в отличие от грызунов, что позволяет экстраполировать полученные данные на человека с большей достоверностью. Как показала практическая работа с животными, свиньи активно контактируют с экспериментаторами и легко усваивают когнитивные и пространственные задачи, способны различать несколько разнонаправленных стимулов при одновременном предъявлении в рамках одной задачи. Разработанная на основании ближайших аналогов Т-образного лабиринта методика, основанная на формировании сложного поискового поведения, обусловленного пищевым подкреплением с решением поставленной задачи, позволяет проводить оценку долговременной и кратковременной памяти свиней, а также процессов консолидации памятного следа.

Валидность разработанной методики подтверждена при внутривенном введении скополамина, препарата с доказанным негативным влиянием на когнитивные процессы. При применении скополамина в дозе 0,28 мг/кг показано нарушение воспроизведения как сформированного навыка, так и вновь полученного. Подтвержден срыв процесса перехода вновь приобретенной информации в долговременную память при сохранении ранее приобретенного навыка.